【PROTAC】新药开发系列（十一）降解CDK4/6蛋白

2019年2月13日，Texas A & M University化学系Kevin Burgess课题组在《Chemical Communications》上发表了一篇应用PROTACs降解CDK4/6的研究文章。这是第一次报道CDK4/6被含CRBN的E3体系降解。同时，还有一个研究组也发表了一篇更令人兴奋的文章，他们设计的PROTACs分子可以选择性降解CDK6，而非CDK4，这是抑制剂无法做到的，敬请期待下周我们的微信文章。

有趣的事：

我们利用分迪科技的蛋白降解小分子新药开发平台（PRODED）在去年7月就预测了含CRBN的E3体系可降解CDK4/6。

1摘要

研究者基于两种FDA已批准的CDK4/6抑制剂设计了两类PROTACs。基于Palbociclib的PROTAC能有效地降解CDK4和6，并抑制视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，使得细胞周期停滞。并且，这些PROTACs仅在纳摩尔浓度下就具有降解蛋白的活性。

2背景

细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）对细胞周期调节至关重要。癌症中的细胞周期停滞可抑制肿瘤生长和转移，因此抑制CDK是一个热门的研究领域。第一代CDK抑制剂在该系列的不同成员之间几乎没有或没有选择性，因此并未成药。直到第一种选择性CDK4/6抑制剂的出现彻底改变了该研究领域。2015年，Palbociclib（IBRANCE®）获得美国联邦药品管理局的加速批准，用于雌激素受体阳性，HER2阴性晚期乳腺癌的联合治疗。第二种选择性CDK4/6抑制剂Ribociclib（KISQALI®）于2017年被批准用于治疗上述相同的适应症。截至目前，Palbociclib和Ribociclib至少有20项正在进行的临床试验，用于治疗乳腺转移，肺癌（非小细胞）前列腺癌，胰腺癌和脑癌（胶质母细胞瘤）。因此，我们非常期望这些药物获批用于治疗其它癌症。

Palbociclib和Ribociclib均选择性地抑制CDK4和6。CDK4/6在细胞周期的G1-S期是很重要的，因为它们诱导Rb蛋白磷酸化的一系列事件。阻止Rb磷酸化导致细胞发育停滞，其效果在化疗中已被证明。

PROTACs是两个分子的嵌合体：一个结合靶向泛素化的蛋白质，另一个与E3泛素连接酶特异性识别。这些嵌合体可以强制靶蛋白和E3连接酶接近，从而引发靶蛋白的泛素化，然后利用蛋白酶体降解靶蛋白。PROTACs一个引人注目的特征是：它们在细胞中诱导泛素化的催化作用。因此，它们甚至比使用抑制剂更有效。

PROTAC的机制不同于激酶抑制，因为它们可完全破坏蛋白。最近，已有报道降解CDK8和9的PROTACs分子。这促使研究者开展了基于Palbociclib和Ribociclib的PROTACs研究（图1a）。图1b和c显示了其分别与CDK6的晶体复合物结合模式。这两种CDK抑制剂都的哌嗪-N都暴露在溶剂中，于是研究者假设该位点适合接出Linker与E3连接酶配体连接。我们将结合CRBN的Pomalidomide与Palbociclib和Ribociclib分别用Linker连接起来，形成新的PROTAC，并测定它们对CDK4/6的降解和抑制Rb磷酸化的效果。

图1  PROTAC 降解CDK4/6的示意图和CDK6复合物

3结果

实际上，该研究的PROTAC是通过将来自Pomalidomide 的已知叠氮化物与Palbociclib或Ribociclib的N-炔丙基衍生物连接起来制备的，如方案1中所示。

方案1 PROTACs的合成方案

研究者在MDA-MB-231三阴性（雌激素受体，孕酮受体和HER2阴性）乳腺癌细胞系中检测了这两种PROTACs（pal-pom和rib-pom）的蛋白降解效果。如图2a和b所示，与MDA-MB-231细胞共孵18小时，pal-pom剂量依赖性地耗尽CDK4和CDK6，但rib-pom的消耗程度不是线性的。此外，pal-pom和rib-pom降解CDK4的效果优于CDK6，DC₅₀（50％蛋白质降解的浓度）分别为~15和~100nM（图2c和d）。细心的读者可能会注意到图2a和b中显示，用两种CDK4/6抑制剂处理细胞，反而使细胞中的CDK4/6水平提高。研究者尚不清楚导致这种现象的原因，但似乎细胞在某种程度上开启了反馈调节机制，用以弥补CDK4/6被抑制。实验显示，PROTACs降解CDK4/6的效果受Linker长度的影响。研究者用稍短的Linker合成的pal-pom和rib-pom没有发现其蛋白降解效果。由于pal-pom诱导的降解比rib-pom更有效，因此该研究接下来的部分仅关注pal-pom及其衍生物。

图2 降解MDA-MB-231细胞系中的CDK4/6

视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化受CDK4和CDK6的调节。因此，这些细胞周期蛋白依赖性激酶的消耗应该降低磷酸化Rb的水平。图2a和b中的WB实验显示，PROTACs确实以剂量依赖性方式降低Rb的磷酸化。研究表明，用100nM的 pal-pom处理相同的三阴性乳腺癌细胞系，4小时后产生最佳的CDK4降解，而CDK6的最佳降解时间至少需6小时（图3）。更高浓度PROTAC（300nM的 pal-pom）可以加速CDK4和CDK6在细胞中的降解。

图3 降解CDK4/6的动力学

研究者又进行以下试验以证实pal-pom通过泛素-蛋白酶体途径降解CDK4/6（图4a）。首先，使用10μM的Palbociclib和Pomalidomide分别与pal-pom竞争性结合CDK4/6和CRBN。试验显示，CDK4/6和CRBN位点被过量的抑制剂竞争性占据，使PROTAC无效。接下来，观察到用Palbociclib预处理提高了CDK4/6的表达水平。另一个试验，研究者添加了NEDD8抑制剂MLN4924（1μM），结果显示其阻止了Cullin-RING连接酶的激活，导致含CRBN的E3无法发俗话标记CDK4/6。用MLN4924预处理同时引起了CDK4表达水平的增加，类似于用Palbociclib的预处理。最后，研究者用20μM的蛋白酶体抑制剂MG-132预处理细胞。这种情况下，与用0.1％DMSO预处理的样品相比，大多数CDK4/6在PROTAC处理18小时后仍然存在。该结果表明PROTAC（pal-pom）的确是通过泛素-蛋白酶体途径降解CDK4/6。

图4 通过泛素-蛋白酶体途径降解CDK4/6

催化作用是PROTACs的一个重要特征，但要证明这一点很困难。一个指标是，细胞活性实验中PROTACs的DC₅₀是否低于其与结合靶蛋白的离解常数（K_d）。这可用KINOMEscan™测量pal-pom与CDK4和6结合的K_d值。KINOMEscan™通过组合DNA标记激酶，固定化配体和测试化合物进行。它是一种竞争性结合试验，具有固定的活性位点定向配体，其中测试样品与固定化配体竞争的能力通过 DNA标记激酶的定量PCR 测量（表1）。结果显示，pal-pom对CDK4/6的DC₅₀值（从图2推导）确实低于激酶结合pal-pom的K_d值，表明降解是催化的。另外，CDK4/6抑制剂与激酶结合的K_d值小于相应PROTAC 的K_d值。

表1 CDK4/6抑制剂和PROTACs的Kd和DC₅₀值的比较

激酶抑制剂如Palbociclib和Ribociclib是诱导细胞凋亡而非细胞毒性。pal-pom和rib-pom对MDA-MB-231细胞的毒性是适度的（IC₅₀估计在10-50μM范围），但这些化合物的溶解性限制了其定量。

4讨论

上述工作是使用三阴性乳腺癌细胞系进行的，而不是FDA批准的雌激素受体阳性和HER2阴性乳腺癌细胞。为了进一步研究这些PROTACs的作用，研究者对MCF-7乳腺癌细胞进行了类似的试验，这些细胞是雌激素受体阳性和HER2阴性的。结果显示，PROTAC（ pal-pom）对该细胞中CDK4/6的降解和细胞毒性不如对MDA-MB-231细胞那样有效。然而，它确实可以长时间抑制MCF-7细胞增殖（最多6天）。这一观察结果促使研究者尝试一种完全不同类型癌症的细胞系：胶质母细胞瘤U87细胞系。结果表明，20-200nM的pal-pom和rib-pom都显著消耗了该细胞系中的CDK4。

综上所述，研究者第一次报告了可以降解CDK4/6的PROTACs。这一发现比降解CDK8/9更为重要，因为只有CDK4/6是有效的癌症靶点。这里的PROTACs含有FDA批准的激酶抑制剂。此外，pal-pom（DC₅₀为20-50nm）的蛋白降解能力明显高于报道的降解CDK8和9的PROTACs。为了进一步校准，表S1还总结了其它完全不同的激酶和相关蛋白上的PROTACs的DC₅₀用以这支持研究者的观点，即本文报道的化合物相对有效。最后，研究者观察到pal-pom和rib-pom在U87胶质母细胞瘤细胞中的活性，预示该PROTACs在其它癌症中的应用前景。

参考文献

doi: 10.1016/j.chembiol.2018.11.006

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